Genel Bilgiler
1. Besiyeri nedir?
#
Besiyerleri (besi ortamı, ortam,
vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) mikroorganizmaların
geliştirilmesi için formülize edilmiş ortamlardır. Bunlar,mikroorganizmaların
geliştirilmesi, izolasyon, identifikasyon, sayım, duyarlılık testleri,
sterilite testleri, klinik örneklerin incelenmesi, gıda, su ve çevre
kontrolleri, biyolojik ürünlerin elde edilmesi, antibiyotik ve vitamin
analizleri, endüstriyel analizler vb. gibi çok farklı amaçlara yönelik
olabilir.
2. Besiyeri Hazırlama Şekilleri
Besiyeri bileşimine giren maddeler ayrı ayrı tartılır, ya
da hazır dehidre besiyeri doğrudan tartılarak su içinde çözülür. En basit
olarak; Nutrient Broth'un bileşimi litrede 5 gram pepton ve 3 gram et ekstraktı
şeklindedir. Besi yeri tartılıp sulandırıldıktan sonra pH sı kutu üzerinde
yazılan bilgilere göre ayarlanır. Uygun şartlarda otoklavda steril edilir. 121 oC'da
15 dakikada,
Otoklav veya ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası besiyerleri
çoğunlukla Petri kutularına dökülerek kullanılır. Besiyeri dökülmeden önce,
homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır. Besiyerleri, her zaman erlen
gibi büyük kaplarda sterilize edilir ve sterilizasyon sonrası steril Petri
kutularına aseptik koşularda dökülür.
Petri kutularına dökülecek besiyeri miktarının "en az
2–3 mm" olması önerilmektedir. Bu da yaklaşık 12,5 mL'ye denk gelmektedir.
(Yani 100 mL lik besiyeri 8 Petri kutusuna dağıtılır).
Agarlı besiyerinin dökme sıcaklığı, otoklav sonrası
besiyerinin yaklaşık 45 oC'a soğutulması ve bu sıcaklıkta Petri
kutularına dökülmesidir. Yüksek
sıcaklıklarda dökme, Petri kutusunun kapağı içinde aşırı su
yoğunlaşmasına yol açar. Ayrıca yüzey kurutması daha uzun zaman alır. Besiyeri
döküldükten sonra Petri kutuları yatay bir zeminde soğumaya ve katılaşmaya
bırakılır.
Kurutma: Petri kutularına dökülmüş agarlı besiyerlerinde yüzeyin
ıslak olması istenmez. Islak yüzeylerde hareketli bakteriler yayılıcı tip
koloni oluştururken, hareketsizler olduklarından daha büyük koloni meydana
getirir ve yanlış değerlendirmelere neden olur.
#
Tersine olarak, aşırı kurumalar
da olumsuz sonuç verir. Koloniler aşırı kurumuş bir besiyerinde normalinden
daha küçük boyut oluşturacakları için yine hatalı değerlendirmelere neden olur.
#
Kurallara uygun olarak Petri
kutularına dökümde yüzey hafif nemli olur. Öze ile sürme gibi bir çalışma
yapılacaksa, kurutma özellikle yapılmalıdır. Besiyerinin kurutma gerektirip
gerektirmediği basit olarak yüzeyde su damlacıklarının görülmesi ile anlaşılır.
Dökümden sonra besiyeri yüzeyinin kurutulması 2 farklı
yöntem uygulanabilir.
- Çabuk
kurutma yönteminde: kuruma hızlı olur, ancak kontaminasyon riski
yüksektir. Çabuk kurutma sadece acil durumlarda uygulanmalıdır. Kuru hava
sterilizatörlerinde kurutma sırasında sıcaklığın 50 oC'da
tutulması hızlı bir kuruma sağlar. Ancak bu uygulamada besiyerinin aşırı
kuruma riski de vardır.
- Geç
kuruma yöntemi: düşük kontaminasyon riski sağlar. Prensip olarak
benimsenen şekil güvenli kurutmadır. Kurutma, mutlaka temiz ve serbest
hava akımı olmayan yerlerde yapılmalıdır. Steril hava akımı ile çalışan
aşılama kabini (Laminar air flow), sterilizasyon amacıyla kullanılan ve
kurutma sırasında çalıştırılmayan etüvler (kuru hava sterilizasyon fırını)
ve UV lamba ile sterilize edilen kabinler kurutma için kontaminasyon
olmaması açısından en güvenilir yerler arasındadır.
Besiyerleri hazırlanırken amaç, hedef organizmanın
gelişmesini optimize edecek konsantrasyonlarda gerekli besin maddelerinin
dengelenmiş karışımını sağlamaktır. Bütün besin öğelerini oldukça fazla
miktarda sağlayarak, olabildiğince zengin bir besiyeri yapma yaklaşımı ile
optimal besiyeri elde edilemez. Örneğin,
aminoasitlerin dengelenmemesi ve bir amino asidin fazla olması, ilişkili bir
amino asidin gelişme için kullanımını baskılayabilir. Glikoz dahil olmak üzere
tüm besin öğeleri, konsantrasyonları arttıkça baskılayıcı etki yaparlar.
#
Besiyeri bileşimine giren
maddeler gelişme açısından; a)Gelişme için gerekli olanlar, b)İnhibitörler,
c)Diğerleri olmak üzere 3 gruba ayrılabilir. Gelişme için gerekli olan maddeler
doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve besiyeri
içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunur. İnhibitörler ise gelişmesi
istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave
edilir. Bunların dışında yine gerektiğinde indikatörler, jelleştiriciler vb.
pek çok madde de besiyeri bileşimine girer.
Depolama
#
Kapağı açılmış besiyerleri ve besiyeri bileşenleri kuru,
karanlık ve serin bir yerde saklanmalıdır. Toz haldeki besiyeri ve bileşenleri
için en büyük tehlike bunların nem almasıdır. Orijinal ambalaj kapağının
açılmasından sonraki raf ömrü, saklama koşullarına doğrudan bağlıdır.
Laboratuvarda hazırlanmış
çözeltilerin pek çoğu ışığa duyarsızdır ve soğukta saklanması gerekmez. Buna
göre tercihen cam çözelti şişelerinde ve oda sıcaklığında depolanabilirler.
Işığa duyarlı olan çözeltilerin
amber renkli şişelerde depolanması gerekir. Benzer şekilde bazı çözeltiler buz
dolabında korunmalıdır.
Besiyerleri katkı ilave edilmemiş olmak kaydı ile
buzdolabında en çok 3 ay, oda sıcaklığında en çok 1 ay süre ile depolanabilir.
3. Besiyeri çeşitleri
a. Genel Besiyerleri
#
Herhangi bir inhibitör madde
içermeyen, besin maddelerince yeterli veya zengin, herhangi bir mikroorganizma
grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişenlerin de dahil
olduğu çok sayıda mikroorganizmanın gelişmesini sağlayan besiyerleridir.
#
Bu grupta değerlendirilen
besiyerleri genel olarak bakteriler için kullanılır. Bununla beraber, bu
besiyerlerinde maya ve küfler de gelişebilir. Genel besiyerleri başlıca toplam
mezofil aerob bakteri sayımı, toplam psikrofil aerob bakteri sayımı, bozulma ya
da hastalık etmeninin ön izolasyonu gibi amaçlar için kullanılır. Buna göre;
Toplam mezofil aerob bakteri
sayısından kasıt 28–30 oC'da (kimi kaynaklara ve amaca göre 35–37 oC'da)
gelişebilen aerob bakterilerin sayısıdır. #-Günlük kullanımdaki bakterilerin aktifleştirilmesi, basit
olarak korunması vb. amaçlarla da genel besiyerleri yaygın olarak kullanılır.
Tüm bakterilerin geliştirilebileceği nitelikte bir besiyeri yoktur.
Genel besiyerleri, inkübasyon
koşullarının değiştirilmesi ile psikrofillerin, termofillerin,
mikroaerofillerin, aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanması
ile kısmen anaerobların geliştirilmesinde de kullanılır. Gıda mikrobiyolojisi
açısından ele alındığında, Plate Count Agar, Nutrient Agar ve Nutrient Broth,
CASO (Tryptic Soy) Agar ve CASO (Tryptic Soy) Broth en sık kullanılan genel
besiyerleri içinde yer alırlar. Ayrıca, Brain–Heart (Infusion) Broth ve
Brain–Heart Agar ile Tamponlanmış Peptonlu Su da genel besiyeri olarak
değerlendirilir. Kanlı Agar ise, basit bileşimli bir genel besiyerine kan
ilavesi ile hazırlanır.
b.Selektif Besiyerleri
#
Selektif besiyerleri, karışık
bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyen mikroorganizmları baskılamak, gelişmesi
istenenleri minimum düzeyde olumsuz etki yapmak üzere formülize edilir. Bu
amaçla genellikle çeşitli inhibitör
maddeler kullanılır.
#
İnhibitörlerin konsantrasyonu
ile baskılanması hedeflenen mikroorganizmaların cins ve türlerine göre değişmek
üzere, selektif besiyerleri bunlar için zayıf, orta veya yüksek selektivite
gösterir. Yüksek selektivite gösteren
besiyerleri, tek cins ya da türde mikroorganizma gelişmesine izin vereceğinden
bu besiyerleri selektif izolasyon, selektif sayım ve hatta ön
identifikasyon amaçları ile
kullanılabilir.
#
Bununla birlikte, sadece bir tür
mikroorganizmanın gelişebileceği selektivitede besiyeri örneği çok azdır. Bu
gibi örnekler, gelişmesi istenen mikroorganizmanın belirli bir inhibitöre aşırı
direnç göstermesi ile ilgilidir.
#
Cetrimide Agar ise pseudomonas
için selektiftir. İçindeki Nişasta
ve glutamat Pseudomonas ve Aeromonas türleri tarafından besin
maddesi olarak kullanılır. İçerdiği Cetrimide ile
rekabetçi florayı baskılar.
Baird Parker agar, Stafilacoclar için spesifik besi
yeridir. İçindeki Lityum klorit,
tellirüt refakatçi florayı baskılar.
TCBS (Tiosülfat sitrat bile sukroz) agar, Vibrio spp için
spesifiktir. Bu besiyerindeki tiyosülfat,
sitrat ve alkali ortam
enterobacterlari, ox bile ve cholate enterococları baskılar.
TSC (Triptose sulfite sikloserin) Clostridium perfiringens
gelişimini sağlar. İçindeki sikloserin refakatçi
florayı baskılar.
Endo agar koliform bakteriler ve E coli için selektif besi
yeridir. İçindeki sodyum sülfit, fuksin
G(+) bakteri baskılar.
EMB (Eozin metilen blue) enterobactericea ve koliform grup
bakteriler için spesifiktir. İçindeki metilen blue, eosin, yellowish boyaları G(+) bakteri başta olmak üzere
rekabetçi florayı baskılar.
Sorbitol macConcey Agar E coli O157:H7 için spesifik besi
yeri olup, içindeki safra tuzlar,
kristal viyole, G(+) mikrobiyel florayı baskılar.
c. Zenginleştirme Besiyerleri
Karışık bir mikroflora içinde
hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek, sayısını artırmak, hücrede olası
hasarların giderilmesini sağlamak vb. amaçlarla kullanılan zenginleştirme
besiyerleri, ön zenginleştirme
besiyerleri ve selektif zenginleştirme besiyerleri olarak 2 alt gruba
ayrılır.
#
Ön zenginleştirme besiyerleri genel olarak hasar görmüş
(yaralanmış, stres altında) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için
kullanılan, bileşiminde inhibitör
içermeyen, dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında
refakatçi mikrofloranın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir. Buna göre
"özel amaçla kullanılan genel besiyerleri" olarak da
nitelendirilebilirler.
#
Bu besiyerlerine en tipik örnek,
gıdalarda Salmonella aranmasına
yönelik çalışmaların ilk aşaması olan ön zenginleştirmede kullanılan "Tamponlanmış Peptonlu Su"
besiyeridir. Bileşimi 10 g/L et peptonu, 5 g/L NaCl ve 10 g/L fosfat tampon
olan bu besiyerinde Salmonella yanında ortamdaki diğer bakteriler de
kolaylıkla ve iyi bir şekilde gelişebilir.
#
Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besiyerleridir.
Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden
gelişmesi istenmeyenler, çeşitli selektif inhibitörlerin kullanımı ile kısmen
ya da tümüyle engellenir. Bunlara en tipik örnekler Listeria ve Salmonella aranmasında kullanılan
besiyerleridir.
Ör: Rappaort Vasillialis Salmonella spp için spesifik besi
yeridir. İçindeki malaşit yeşili ve MgCl2, Salmonella dışında bakterilerin
üremesini baskılar.
EC broth fekal koliformlar ve E.coli için spesifik besi
yeri olup içerdiği safra tuzları, ve
yüksek inkubasyon sıcaklığı G(+) bakteri başta olmak üzere rekabetçi
florayı baskılar.
Örnek Alma, Homojenizasyon ve Seyreltme
Örnek Miktarı
#
Pek çok ulusal ve uluslararası
standart, analiz edilecek gıda miktarını 10 g (mL) olarak verir. Bu değer
sadece sayım yapılacak analizler için geçerlidir. Patojenler genellikle 25 gram
gıdada var/yok testi ile analiz edilir.
Kamu tarafından yapılan denetlemelerde
5 örnek ile çalışılma zorunluluğu vardır. Bunun nedeni, kamunun, analiz ettiği
gıdayı, gıda yasalarına uyup uymadığı açısından denetlemesidir. Alınan örnek
sayısının ilgili partiyi temsil etmesi ayrı bir sorundur ve genellikle partinin
ne kadar homojen olduğu ile de yakından ilişkilidir.
n:
Analize alınacak örnek sayısı,
c: M
değeri taşıyabilecek en fazla örnek sayısı,
m: (n
– c) sayıdaki örnekte bulunabilecek en fazla değer,
M: c sayıdaki örnekte bulunabilecek en fazla değer olarak
tanımlanır.
Örnek:
n= 5; c= 2; m= 5.000; M= 50.000 ise;
#-5 (n) adet örnekten 2
adedinde (c) mikroorganizma sayısı en fazla 50.000 (M) olabilir.
#-5
örnekten (n) geriye kalan 3 adedinde (n-c) mikroorganizma sayısı en fazla 5.000
(m) olabilir.
#-5 örnekten (n) biri
50.000 değerini (M) geçerse parti reddedilir.
#-5
örnekten 3 ya da daha fazlasında 5.000 (m) değeri geçilirse yine parti
reddedilir. Çünkü, c= 2 olması gerekirken bu durumda 3 ya da daha fazla sonuç
elde edilmiş olacaktır. Bu örnek genellikle toplam bakteri gibi genel kalite
kriteri olan analizler için verilmiştir.
##n= 5; c= 1; m= 0; M= 9 ise;
5 (n) adet örnekten sadece 1 (c)
adedinde en fazla 9 (M) mikroorganizmaya izin verilir ancak diğer sayımlar 0 olmalıdır.
Bu sayının herhangi bir ya da daha fazla örnekte 9'dan fazla olması ve/veya 2
ya da daha çok örnekte 1–9 arasında olması halinde parti reddedilir. Bu örnek
genellikle koliformlar gibi hijyen indikatörü analizleri için verilmiştir.
#
##n= 5; c= 0; m= 0; M= 0 ise;
5 adet (n) örneğin hiçbirinde
aranan mikroorganizma bulunmamalıdır. Sayı önemli değildir, bir ya da daha
fazla örnek pozitif olarak değerlendirilirse parti reddedilir. Bu örnek
genellikle Salmonella, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7
serotipi gibi patojenlerin analizi için verilmiştir.
Homojenizasyon
#
Genellikle katı ve yarı katı
gıdaların bir homojenizasyon çözeltisi içinde homojen hale getirilme işlemidir.
Sıvı gıdalar zaten homojen bir dağılım gösterir. Burada homojenlikten kasıt,
gıdadaki mikroorganizmaların analiz yapılacak tüm kütleye homojen olarak
dağıtılmasıdır.
#
Homojenizasyon işlemi ister
sayım, ister var/yok testleri amacıyla kullanılsın, genel olarak 1:9 oranında
yapılır. Buna göre 1 kısım gıda 9 kısım çözelti ile homojenize edilir. Var/yok
testlerinde ise, 1 kısım gıda 9 kısım besiyeri ile homojenizasyon işlemine
alınır. Sayım yapılacak ise 1:9 oranında homojenizasyon, aynı zamanda 10–1
seyreltme olarak da kullanılır. Bu nedenle homojenizasyonda gıda ve
homojenizasyon çözeltisinin miktarına özen gösterilmelidir.
Seyreltmede en yaygın kullanılan
çözeltiler
n %0,85 NaCl (Serum fizyolojik, fizyolojik tuzlu su),
n peptonlu su (%0,1),
n peptonlu serum fizyolojik (%0,85 NaCl + %0,1 pepton),
n pepton–tuz
(saline–peptone)"
n Tamponlanmış
Peptonlu Su
n ringer çözeltisi (peynir ve süt ürünlerinde)
n Tween
80 (yağ oranı yükseklerde)
n Triton
X 100 (Mayonez)
Homojenizasyon ve Seyreltme İşlemi
Gıdanın çeşidine göre değişmek üzere gıdada homojenizasyon
ve/veya seyreltme yapılması gerekebilir. Homojenizasyon (ilk seyreltme) ve
sonraki seyreltmeler, standart olarak 1:9
oranında yapılır. Bunun için başlangıçta 10 g gıda örneği 90 mL
seyreltme çözeltisi ile homojenize edilir. Salmonella, E. coli O157:H7
serotipi ve Listeria analizinde ise 25 g gıda 225 mL besiyerine ilave
edilir. İlk seyrelti (10–1) yapıldıktan sonra 10–2 ve 10–3
seyreltilere yine aynı seyreltme çözeltisi ile devam edilir.
Standart gıda analizlerinde daha fazla seyreltmeye gerek
yoktur. Bu seyreltmeler steril 1 mL'lik pipet kullanılarak standart şekilde
yapılır. Bu amaçla erlenden 1 mL alınıp, 9 mL seyreltme sıvısına aktarılır ve
tüp karıştırıcıda karıştırılır. Bu şekilde 10–2 seyrelti elde
edilir. Buradan bir başka steril pipet ile 1 mL alınıp diğer tüpe aktarılır ve
yine mekanik tüp karıştırıcıda karıştırılır. Bu tüp ise 10–3
seyreltidir.
Mikroorganizma
Analiz Yöntemleri
1. Katı besi yerinde kullanılan ekim
yöntemleri
Katı besiyeri kullanılarak yapılan sayımın prensibi
"her canlı hücrenin belirli bir inkübasyon sonunda 1 adet koloni
oluşturması"dır. Bununla birlikte, canlı olduğu halde hasar görmüş ve
gelişip koloni oluşturamayacak canlı hücreler de gıda maddesinde bulunabilir.
Bu nedenle sayım sonuçları "sadece koloni oluşturabilenlerin"
sayıldığını göstermek üzere "koloni oluşturan birim; kob (colony forming
unit; cfu)" olarak verilmektedir. Katı besiyeri kullanılan standart yöntemler
dökme, yayma ve damlatma olarak üç ana grupta ele alınır. Çizme plak yöntemi
daha çok bakterilerin var /yok analizi ya da bakteri pasajlamak amacıyla
kullanılır.
Dökme plak: Bu
yöntemde steril petri kutusuna analizi yapılacak sıvı gıda maddesinden doğrudan
ya da uygun seyreltisinden 1 mL aktarılıp, üzerine donma sıcaklığının biraz
üzerinde (yaklaşık 45 oC) agarlı besiyeri dökülür ve karıştırılır.
Agar donunca Petri kutusu inkübasyona bırakılır. İnkubasyon sonunda koloniler
sayılır. Sonuçlar 1 g veya 1 ml numune için hesaplanır. Ör: 102
dilüsyondan 1 ml ekim yaptığımız süt numunesinden petride 30 koloni saydık
diyelim. 1 ml de sütte kaç bakteri vardır?
Koloni sayısı X sulandırma oranı X 1 hesabından; 30 x 102
X 1 = 3000 kob/g elde edilir.
Yayma plak: Bu yöntemde
ise, petri kutusuna önce agarlı besiyeri dökülür, katılaştıktan sonra sıvı gıda
maddesinden doğrudan ya da uygun seyreltisinden 0,1 mL aktarılıp, "Drigalski
spatülü" olarak adlandırılan cam çubuk ile yayılır. Gıdadaki
mikroorganizma sayısı bu yöntemin kullanılabileceği kadar yüksek ise, dökme
yöntemine tercih edilmelidir. Bu konuda, analiz edilecek gıdadaki
mikroorganizma sayısı bağlayıcı olmakla beraber, laboratuvarın tercihleri de
önemlidir. Ör: 102 dilüsyondan 0.1 ml ekim yaptığımız süt
numunesinden petride 30 koloni saydık diyelim. 1 ml sütte kaç bakteri vardır?
Bu kaç bakteriye denk geliyor. Koloni sayısı X sulandırma oranı X 10
hesabından; 30 x 102 X 10 = 30000 kob/g elde edilir. Hiç üreme yoksa <1.101
kob/g
Damla Plak: Uygun
dilusyonları yapılmış gıda numunesi (1 ml örnek +9 ml peptonlu su) daha önceden
dökülüp katılaşmış besiyerine 50 μL (0.05 ml) damlatma yöntemi ile ekim
yapılır. Bu yöntemin en büyük avantajı tek Petri kutusu üzerine 4–6 damla aktarılması,
diğer bir deyiş ile, besiyerinden 4–6 misli tasarruftur. Ancak, kolonilerin
sağlıklı bir şekilde sayılamaması nedeni ile hiçbir koşulda günlük analizde
kullanılmaz. Zorunlu hallerde titre belirlenmesi için kullanılabilir. Ör: 102
dilüsyondan 0.05 ml ekim yaptığımız süt numunesinden petride 30 koloni saydık
diyelim. 1 ml sütte kaç bakteri vardır? Bu kaç bakteriye denk geliyor. Koloni
sayısı X sulandırma oranı X 20 hesabından; 30 x 102 X 20 = 60000
kob/g elde edilir. Hiç üreme yoksa <2.102
kob/g
Çizme plak: Bu
yöntem daha çok bakterilerin var /yok analizi ya da bakteri pasajlamak amacıyla
kullanılır. Öze ile ekim yapılır.
2. En
Muhtemel Sayı Yöntemi
#
Sıvı besiyeri kullanılan
"En Muhtemel Sayı; EMS (Most Probable Number; MPN)" yöntemi
anlaşılır. Bu yöntem, eski kaynaklarda "Kuvvetle Muhtemel Sayı; KMS"
olarak da anılır. Yöntemin esası, ardışık 3 seyreltiden 3'er adet sıvı
besiyerine 1'er mL ekim, inkübasyon sonunda tüplerin pozitif ya da negatif
olarak değerlendirilmesi ile elde edilecek kodun, istatistik yöntemlerle elde
edilmiş çizelgeden okunmasıdır.
Gıda örneği 1:9 oranında homojenize edilip (10–1),
bundan standart yöntemle devam edilerek 10–2 ve 10–3
seyreltiler elde edilir. Her seyreltiden 3'er adet sıvı besiyerine ayrı ayrı
1'er mL aktarılır. Gıdada beklenen ya da hedef alınan sayıya göre ilk
seyreltiden çift kuvvette hazırlanmış besiyerlerine 10'ar mL ekim yapılabilir. İnkübasyondan
sonra bütün tüpler (+) ya da (−) olarak değerlendirilir. Bu, basitçe bulanıklık
ve/veya gaz oluşumu ile yapılabileceği gibi, muhtemel pozitif tüplerden sıvı ya
da katı besiyerlerine ekim yapılabilir.
EMS yönteminin
uygulanışı ve kod kavramı:
Örneğin 1 mL'sinde 800 canlı hücre olduğu varsayılır ise
10–1 seyreltide mL'de 80; 10–2 seyreltide mL'de 8 ve 10–3
seyreltide mL'de 0,8 adet bakteri olacaktır. mL'de 0,8 adet bakteri olmasının
anlamı 1 mL'de 1 adet bakteri bulunma olasılığının %80 olmasıdır. Buna göre bu
tüpten yapılan ekim %80 olasılıkla (+) ve %20 olasılıkla (−) sonuç verecektir. Benzer
şekilde 10–4 seyreltiden yapılan ekimde %8 olasılıkla (+) ve %92
olasılıkla (−) sonuç
alınır. Daha sıklıkla beklenildiği gibi 10–3 seyrelti pozitif ve 10–4
seyrelti negatif sonuç verirse, analiz edilen örnekte 1.000 ile 10.000/mL
arasında bakteri olduğuna karar verilir, oysa sadece 800
adet/mL bakteri vardır. Bu nedenle sonuçlar, yarı
kantitatif yaklaşımla verilmez.
Her seyreltiden 3'er tüpe ekim yapıldığına göre bu 3 tüpün
kaç adedinde (+) sonuç alındığı sayılır ve bu şekilde kod elde edilir. Kod,
ardışık 3 seyreltinin (+) değerleridir.
Diğer bir deyiş ile eğer 100 ; 10 0, 10–1
ve 10–2 serisi alınırsa kod 3
3 3
Eğer 10–3 ; 10–4 ve 10–5
serisi alınırsa bu kez kod 2 0 0
olmaktadır.
Tüplerin Değerlendirme Kuralları
EMS yönteminde her tüpün pozitif ya da negatif olarak
değerlendirilmesi esastır. Buna göre tüplerin değerlendirilmesi, kullanılan
besiyeri ve analiz yöntemine göre birbirinden çok farklı şekillerde yapılır.
Aşağıda Şekil 6 da verilen örnek incelenirse ardışık 4 seyreltiden ekim
yapılmış, koliform grup için 3 3 2 1 şeklinde muhtemel pozitif sonuç elde
edilmiş, sadece pozitif sonuç veren tüplere doğrulama testi yapılmış ve bu kez
3 3 1 1 şeklinde sonuç elde edilmiştir. Doğrulanmış koliform tüplerinde ise E.
coli varlığı araştırılmıştır.
Doğrulanmış koliform sayısı dikkate alındığında 100 serisinden başlanırsa 3 3 1 kodu karşılığı sonuç 46 EMS/mL iken, 10–1
seyreltiden elde edilecek sonuç 3 1 1 kodu karşılığı 75 EMS/mL'dir. Çizelge
06'ya göre gerek 3 3 1 gerek 3 1 1 kodu "1" kategorisi ile
değerlendirilse de ardışık seride seçim kuralına göre 3 3 1 değil, 3 1 1 serisi
esas alınır ve sonuç 75 EMS/mL olarak verilir. Benzer durum E. coli için
de geçerlidir ve 2 1 0 kodu karşılığı olarak sonuç 1,50 EMS/mL olarak verilir.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder